研究背景
惡性黑色素瘤是皮膚癌中蕞致命的類型。雖然它在所有皮膚癌中占比不到 5%，卻導致了約 72% 的皮膚癌相關死亡。早期黑色素瘤患者通過手術切除，5 年相對生存率可達 99%；但晚期或轉移性患者，生存率會大幅下降，區域轉移性患者 5 年生存率為 68%，遠處轉移性患者僅 30%。目前，早期診斷黑色素瘤面臨諸多挑戰，傳統診斷方法如視覺檢查和觸診依賴醫生經驗，現有成像輔助手段，如反射共聚焦顯微鏡、光學相干斷層掃描等，存在設備昂貴、有輻射等問題。近紅外熒光成像雖有應用，但常用的吲哚菁綠（ICG）存在非特異性積累、激光穿透淺、光漂白快等缺點，導致假陽性率高、體內半衰期短。因此，開發更精準有效的黑色素瘤早期診斷方法迫在眉睫。
方案 1 MC1R 靶向的 MSH-TPE-BBT 納米顆粒的制備以及在 808 nm激光照射下荷黑色素瘤小鼠的近紅外二區（NIR-II）熒光成像流程。實驗過程本次實驗旨在制備一種新型的黑色素瘤靶向熒光探針，并對其性能進行全面評估，為黑色素瘤的早期診斷提供新的技術手段。（一）材料準備研究團隊基于聚集誘導發光源（AIEgen）四苯乙烯 - 苯并雙噻二唑（TPE - BBT）和靶向 MC1R 的 α - MSH 類似物（DSPEPEG2000 - MAL - CGG - NLE - Cycic (DHRWK)-CONH2 ），制備了名為 MSH - TPE - BBT NPs 的納米顆粒。實驗材料均為市售，TPE - BBT 按文獻合成，其他材料如 DSPE - PEG2000 - MAL、MC1R 靶向肽等從相應公司購買。此外，還獲取了多種細胞培養相關試劑以及不同細胞系，如人惡性黑色素瘤細胞（A375）、鼠乳腺癌細胞（4T1）、鼠黑色素瘤細胞（B16F10），實驗動物選用 BALB/c 裸鼠 。（二）納米顆粒的制備本次實驗制備了兩種納米顆粒，分別是帶有 MC1R 靶向肽的 MSH-TPE-BBT NPs，以及未添加靶向肽的 TPE-BBT NPs，具體步驟如下：1.準備原料溶液：將1mg（0.84μmol）的 TPE-BBT溶解于1mL 的四氫呋喃（THF）中；另取 9mg（3.11μmol）的 DSPE-PEG2000-MAL溶解于1mL THF中；再將1mg（0.24μmol）的 DSPEPEG2000 - MAL - CGG - NLE - Cycic (DHRWK)-CONH2溶解在適量的乙醇里。2.混合原料：將溶解好的DSPEPEG2000 - MAL - CGG - NLE - Cycic (DHRWK)-CONH2乙醇溶液，倒入含有 DSPE-PEG2000-MAL 的 THF 溶液中，充分攪拌混合均勻。3.超聲處理：向上述兩種溶液中加入去離子水，并使用功率為 150W 的超聲波設備對溶液進行處理，處理時間設定為10 min。通過超聲促使分子更好地分散和相互作用，從而形成穩定且分散均勻的納米顆粒溶液。4.攪拌與過濾：將經過超聲處理的溶液在室溫環境下持續攪拌24 h，使反應充分進行。攪拌結束后，利用 0.22μm 的針頭過濾器對溶液進行過濾操作，去除其中可能存在的未反應完全的大顆粒雜質等。5.儲存備用：經過過濾得到的溶液，就是初步制備好的納米顆粒溶液。在后續實驗使用前，通過超濾的方法對溶液進行處理，調整其濃度到合適的水平。隨后，將溶液放置在 4°C 的黑暗環境中儲存，避免光照和溫度變化對納米顆粒的性質產生影響 。
實驗結果
（一）良好的材料特性
圖 1 （a）TPE-BBT 在不同水分數（fw）的四氫呋喃（THF）/ 水混合液中的熒光發射光譜。（b）TPE-BBT 在 918nm 處的相對熒光強度（I/I?）與 fw 的關系。I?是 TPE-BBT 在 THF（fw = 0%）中的熒光發射強度。分子濃度：10??mol/L；激發波長（λex） = 685nm。（c，d）（c）MSH-TPE-BBT 和（d）TPE-BBT 納米顆粒的粒徑和透射電鏡（TEM）圖像（插圖）。標尺：100μm。（e - f）（e）MSH-TPE-BBT 納米顆粒（λex = 685nm）、（f）TPE-BBT 納米顆粒（λex = 685nm）和（g）吲哚菁綠（ICG，λex = 685nm）的吸收光譜和發射光譜。（h）水中五種不同濃度的 TPE-BBT 納米顆粒以及在二氯乙烷（C?H?Cl?）中的 IR26 在 850 至 1600nm 之間相應發射峰積分的吸光度擬合曲線。激發波長：808nm。（i）連續激光照射下，MSH-TPE-BBT 納米顆粒（920nm 發射峰）、TPE-BBT 納米顆粒（920nm 發射峰）和 ICG（810nm 發射峰）在各自相應發射峰處的相對熒光發射強度（I/I?）。I?：激光照射前的熒光峰強度；I：激光照射后的熒光峰強度。激發波長：808nm。（j）不同厚度雞胸肉組織下 MSH-TPE-BBT 納米顆粒、TPE-BBT 納米顆粒和 ICG 的熒光圖像。1：MSH-TPE-BBT 納米顆粒；2：TPE-BBT 納米顆粒；3：ICG。濃度：0.05mg/mL；激發波長：808nm；功率密度 = 0.7mW/cm2；1000nm 長通（LP）濾光片；曝光時間 = 100ms。（j 由睿光科技的NirVivo-Pro小動物活體成像系統拍攝）（k）MSH-TPE-BBT 納米顆粒、TPE-BBT 納米顆粒和 ICG 的熒光強度與穿透深度的擬合曲線。
通過1HNMR、MALDI - TOF - MS 和元素分析確認 TPE - BBT 成功合成。它在二氯甲烷中 500 - 850nm 有強吸收，750 - 1200nm 有強熒光發射，且具有聚集誘導發光特性。MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 粒徑分別為 122.12nm 和 133.55nm，呈均勻球形，帶負電荷，MSH - TPE - BBT NPs 體系更穩定。二者在 685nm 有蕞大吸收，910nm 有熒光峰，在 NIR - II 區發射優于ICG。TPE - BBT NPs 量子產率達 31.6%，MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 光穩定性強，遠優于ICG，且組織穿透能力也比 ICG 更強。（二）低毒且靶向性好
圖 2 （a）用不同濃度的 MSH-TPE-BBT 納米顆粒、TPE-BBT 納米顆粒和 ICG 處理人黑色素瘤 A375 細胞 24h 后的細胞活力。（b）通過免疫細胞化學可觀察到 MC1R 表達（紅色）、細胞膜（用 DiO 標記，綠色）和細胞核（用 DAPI 標記，藍色）。箭頭分別指示 B16F10 細胞和 A375 細胞中 MC1R 的表達。比例尺：20μm。（c）通過蛋白質免疫印跡法檢測 B16F10、A375 和 4T1 細胞中 MC1R 的表達。（d，e）（d）MSH-TPE-BBT 納米顆粒或（e）TPE-BBT 納米顆粒在 A375 細胞上孵育不同時間后產生的近紅外二區（NIR-II）信號。（f）分別在 18h 和 24h 孵育后，A375 細胞與 MSH-TPE-BBT 納米顆粒或 TPE-BBT 納米顆粒孵育產生的 NIR-II 信號對比。L：MSH-TPE-BBT 納米顆粒。R：TPE-BBT 納米顆粒。（g）A375 細胞在與 MSH-TPE-BBT 納米顆粒或 TPE-BBT 納米顆粒孵育 18h 或 24h 后，NIR-II 信號的統計分析（ns 表示無顯著性差異，** 表示 P < 0.01）。
CCK - 8 實驗顯示，在 0.01 - 0.12mg/mL 濃度范圍內，MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 對A375細胞毒性低，細胞存活率超 85%。免疫 ocytochemistry 和 Western blot 證實 A375 和 B16F10 細胞表達 MC1R，4T1 細胞不表達。細胞實驗表明，MSH - TPE - BBT NPs 靶向性出色，24h 時其在 A375 細胞的熒光強度顯著高于 TPE - BBT NPs。（三）體內成像效果佳
圖 3（a）注射 MSH-TPE-BBT 納米顆粒、TPE-BBT 納米顆粒、ICG 或 PBS 后不同時間點小鼠的熒光圖像。腫瘤以綠色圓圈表示。濃度：0.5mg/mL；激發波長（λex）=808nm；功率密度：0.7mW/cm2；1000nm 長通（LP）濾光片；曝光時間 = 30ms。（a 由睿光科技的NirVivo-Pro小動物活體成像系統拍攝）（b）各組腫瘤信號隨時間變化的統計圖。（c）注射后 36h 離體腫瘤的熒光信號和熒光成像（n=3）。曝光時間 = 100ms。（d-f）小鼠分別注射（d）MSH-TPE-BBT 納米顆粒、（e）TPE-BBT 納米顆粒和（f）ICG 36h 后，用紅線標記的腫瘤的橫截面熒光強度分布。線長：1cm。1：MSH-TPE-BBT 納米顆粒；2：TPE-BBT 納米顆粒；3：ICG；4：PBS。拍攝設別使用
給皮下黑色素瘤小鼠尾靜脈注射 MSH - TPE - BBT NPs、TPE - BBT NPs 或 ICG 后，MSH - TPE - BBT NPs 在腫瘤的熒光信號 36h 達蕞強，且腫瘤滯留時間長、信號強，其腫瘤信號背景比（SBR）為 1.70，優于 TPE - BBT NPs 和 ICG。藥代動力學研究發現，MSH - TPE - BBT NPs 和 TPE - BBT NPs 首先在肝臟和脾臟積累，MSH - TPE - BBT NPs 能逐漸到達并積累在腫瘤，而 ICG 在體內停留時間短、代謝快。血液生化指標和病理切片顯示，MSH - TPE - BBT NPs 生物an全性良好。
圖 4 （a）尾靜脈注射 MSH-TPE-BBT 納米顆粒、TPE-BBT 納米顆粒和 ICG 后不同時間點，它們在體內的生物分布的熒光圖像和明場圖像。激發波長（λex）為 808nm；功率密度為 0.7mW/cm2；使用 1000nm 長通（LP）濾光片；曝光時間為 6ms。（a 由睿光科技的NirVivo-Pro小動物活體成像系統拍攝）（b - f）分別在注射 MSH-TPE-BBT 納米顆粒、TPE-BBT 納米顆粒或 ICG 后（b）24 小時、（c）36 小時、（d）48 小時、（e）168 小時和（f）360 小時，小鼠主要器官和腫瘤的熒光強度統計。1：MSH-TPE-BBT 納米顆粒；2：TPE-BBT 納米顆粒；3：ICG。He：心臟；Ki：腎臟；Li：肝臟；Sp：脾臟；Tu：腫瘤。
研究意義
圖 5（a - d）注射 MSH - TPE - BBT 納米顆粒前以及注射后 1 天、7 天和 14 天的血清生化分析，（a）谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）；（b）總蛋白（TP）；（c）肌酐（CREA）；（d）尿素氮（BUN）（n = 3）。（e）健康小鼠在注射 MSH - TPE - BBT 納米顆粒前以及注射后 1 天、7 天和 14 天主要器官的病理切片（n = 3）。比例尺 = 100μm。
這項研究成功開發的 MSH - TPE - BBT NPs 納米顆粒，在黑色素瘤早期診斷方面展現出巨大潛力。其良好的組織穿透性、光穩定性、生物an全性和特異性靶向性，克服了傳統診斷方法和現有熒光探針的諸多缺陷。未來，有望進一步推動黑色素瘤早期診斷技術的臨床轉化，提高黑色素瘤患者的早期診斷率和生存率，為皮膚癌的防治開辟新路徑。
