本文以 NirVivo-Pro NIR-II小動物活體熒光成像系統作為用于原位腫瘤血管監測和聯合抗血管光熱治療的設備。抗血管治療對腫瘤治療有效，但面臨血管破壞劑疏水性和非靶向性等挑戰，構建腫瘤微環境響應的多模態聯合治療納米平臺意義重大。NIR-II 熒光成像在實時監測腫瘤血管破壞方面有潛力，但現有 NIR-II 光診療劑存在多種問題，開發兼具血管破壞過程實時監測和聯合治療功能的新試劑對療效評估和癌癥治療至關重要。文章報道了開發了一種 pH 響應性的近紅外 II 區（NIR-II）光熱診療劑，用于原位腫瘤血管監測和聯合抗血管 / 光熱治療。
實驗設計
·合成系列分子并制備納米顆粒
以吡咯并吡咯氮雜 - BODIPY（PPAB）為電子受體合成具有 D - A - D 結構的 PT - Xs 系列分子，篩選出 PT - 3，將其修飾為兩親性分子 PTG，再與血管破壞劑 DMXAA 共組裝成 PTDG 納米顆粒，并制備不含 DMXAA 的 PTG 納米顆粒。
圖 1(a)：基于 PPAB 的分子（PT - Xs）的設計與合成。(b)：具有 D - A - D 結構的 NIR - II 分子（PT - 1 至 PT - 4）的化學結構。(c)：通過密度泛函理論（DFT）計算得到的 PT - Xs 的蕞高占據分子軌道（HOMO）、蕞低未占據分子軌道（LUMO）和能隙。(d)：PPAB 和 PT - Xs 在二氯甲烷中的歸一化吸收光譜和 (e) 熒光光譜。
·表征和測試
對合成的分子和納米顆粒進行核磁共振（NMR）、質譜（MS）、紫外 - 可見 - 近紅外光譜、熒光光譜、透射電子顯微鏡（TEM）、動態光散射（DLS）、密度泛函理論（DFT）計算等表征；測試 PTDG 納米顆粒的體外 DMXAA 釋放、光物理性質、光熱轉換效率；通過細胞實驗評估其體外抗血管治療和光熱治療效果；利用 NIR-II 熒光成像技術進行體內全身血管成像、腫瘤血管破壞動態監測、長期腫瘤進展跟蹤和體內聯合治療實驗，并評估 PTG 納米顆粒的長期生物safety。
實驗結果
·PT - Xs 分子的合成與表征
成功合成 PT - 1 至 PT - 4 分子，其吸收和發射波長隨給電子能力增強而紅移，PT - 3 在 NIR-II 區域具有蕞高熒光量子產率（1.37%）和亮度（624.86 M?1cm?1），被選作進一步研究對象。
·PTDG 納米顆粒的制備與表征
PT - 3 修飾后與 PEG 鏈反應得到 PTG，PTG 與 DMXAA 共組裝成 PTDG 納米顆粒，粒徑約 96.0nm，在不同 pH 值下有形態和尺寸變化，酸性條件下可釋放 DMXAA，在正常生理環境中穩定性良好。PTDG 納米顆粒在水中的熒光量子產率為 0.54%（相對量子產率 0.27%），亮度為 119.61 M?1cm?1，NIR-II 成像能力優于吲哚菁綠（ICG），光熱轉換效率為 40.5%，且光熱穩定性良好
圖 2(a)：PTDG 納米顆粒在不同 pH 值（7.4、7.0 和 6.5）的 PBS 中的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。(b)：動態光散射（DLS）分析。(c)：PTDG 納米顆粒在不同 pH 值的 PBS 中 24 小時內 DMXAA 的釋放曲線。(d)：PTDG 納米顆粒的歸一化吸收（空白線）和發射（紅線）光譜。(e)：PTDG 納米顆粒與 ICG 在水中使用 1000nm 和 1100nm 長通濾光片時的亮度比較。(f)：在 750nm 激光照射（0.7W/cm2）下，純水和不同濃度 PTDG 納米顆粒的溫度變化。(g)：PTDG 納米顆粒（100μg/mL）在 750nm 激光照射 15 分鐘后的光熱效應以及冷卻時間與 - ln 的關系圖和冷卻期的線性擬合曲線。(h)：PTDG 納米顆粒在 750nm 激光照射（0.7W/cm2）下五個加熱 - 冷卻循環的溫度變化。
· 體外抗血管治療和光熱治療效果
MTT 和染色實驗表明 PTG 納米顆粒生物相容性好，PTDG 納米顆粒在黑暗中可有效殺傷血管內皮細胞，且在腫瘤酸性微環境下對血管的破壞作用更強，對 4T1 細胞也有顯著的抗血管和光熱聯合治療效果。
圖 3(a)：通過 MTT 法測定不同濃度的 PTG 納米顆粒和 PTDG 納米顆粒在黑暗中孵育 24 小時后人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的相對存活率。(b)：通過 MTT 法測定 4T1 細胞在黑暗中或 750nm 激光照射（0.7W/cm2，10 分鐘）下與 PTDG 納米顆粒孵育后的相對存活率。(c)：用 50μg/mL 的 PTG 納米顆粒和 PTDG 納米顆粒在黑暗中孵育 HUVECs 后的鈣黃綠素 AM / 碘化丙啶（PI）染色的熒光成像。(d)：用 50μg/mL 的 PTDG 納米顆粒在黑暗中或 750nm 激光照射（0.7W/cm2）下孵育 4T1 細胞后的鈣黃綠素 AM/PI 染色的熒光成像。
· 腫瘤血管破壞動態監測
4T1 荷瘤小鼠注射 PTG 或 PTDG 納米顆粒后，腫瘤血管可清晰成像，PTDG 納米顆粒注射后可實時監測腫瘤血管形態變化，10 分鐘左右血管開始受損，35 分鐘后嚴重破壞，而 PTG 納米顆粒處理組無明顯變化；激光散斑對比成像（LSCI）和免疫組化染色證實 PTDG 納米顆粒可造成腫瘤血管嚴重損傷，歸因于酸性腫瘤微環境下 DMXAA 的有效釋放。
圖 4(a)、(b)**：用 1000nm 和 1100nm 長通濾光片對尾靜脈注射 PTG 納米顆粒（150μL，2mg/mL）的 Balb/c 小鼠進行 NIR - II 全身血管成像以及放大的腹部和后肢血管（白色虛線框）圖像。(c)、(d)**：使用 1000nm 長通濾光片時腹部和后肢血管沿白線的橫截面 NIR - II 熒光強度分布。(e)、(f)**：使用 1100nm 長通濾光片時腹部和后肢血管沿白線的橫截面 NIR - II 熒光強度分布。(g)：注射 PTG 納米顆粒后不同時間用 1100nm 長通濾光片對 Balb/c 裸鼠進行 NIR - II 熒光成像。(h)：注射 PTG 納米顆粒后不同時間血液樣本的熒光強度隨時間的變化。
· 長期腫瘤進展跟蹤和體內聯合治療
PTDG 納米顆粒在荷瘤小鼠體內主要分布于肝臟和脾臟，腫瘤部位也有較高積累，注射后 17 天仍可檢測到熒光信號，可長期跟蹤腫瘤進展，這得益于其在腫瘤微環境中酯鍵響應導致的聚集。體內聯合抗血管 / 光熱治療實驗表明，PTDG 納米顆粒聯合治療組腫瘤生長得到完全抑制，組織學分析證實其抗腫瘤效果，且治療過程中所有小鼠體重無異常變化，副作用可忽略不計。
圖 5(a)：靜脈注射 PTG 納米顆粒后整個腫瘤血管的原位 NIR - II 熒光成像。(b)：圖 (a) 中白色實線框內放大的血管圖像。(c)：沿圖 (b) 中白線的橫截面 NIR - II 熒光強度分布以及使用 1100nm 長通濾光片的高斯擬合半高全寬（FWHM）。(d)：靜脈注射 PTDG 納米顆粒后整個腫瘤血管的原位 NIR - II 熒光成像。(e)：圖 (d) 中白色實線框內放大的血管圖像。(f)：沿圖 (e) 中白線的橫截面 NIR - II 熒光強度分布以及使用 1100nm 長通濾光片的高斯擬合 FWHM。(g)：分別注射 PTG 納米顆粒和 PTDG 納米顆粒后，通過對圖 (a)、(d) 中白色虛線框內區域進行 NIR - II 熒光成像實時監測腫瘤血管形態演變。(h)：通過激光散斑對比成像（LSCI）記錄注射 PBS、PTG 納米顆粒和 PTDG 納米顆粒前后腫瘤血管的相對血流速度變化。(i)：注射 PBS、PTG 納米顆粒和 PTDG 納米顆粒后用 CD31 對腫瘤血管進行免疫組化染色。比例尺：50μm。
研究結論
成功構建了基于 PT - 3 的 pH 響應性 NIR-II 納米平臺 PTDG 納米顆粒，兼具高熒光亮度和良好光熱效應，可實現腫瘤血管破壞過程實時監測、長期腫瘤進展跟蹤和聯合抗血管 / 光熱治療，為多功能響應性納米平臺構建和 NIR-II 熒光劑在體內生理過程動態監測中的應用提供了新方法。
圖 6(a)：靜脈注射 PTDG 納米顆粒（150μL，2mg/mL）后 4T1 荷瘤小鼠在 24 小時內的 NIR - II 熒光成像。(b)：靜脈注射 PTDG 納米顆粒后不同時間點腫瘤的平均熒光強度。(c)：靜脈注射 PTDG 納米顆粒后 4T1 荷瘤小鼠在 17 天內的長期 NIR - II 熒光成像。(d)：不同治療組小鼠的紅外熱圖像和 (e) 腫瘤溫度變化。(f)：不同治療后 0 天和 14 天小鼠的照片。(g)：不同治療后隨時間變化的腫瘤生長曲線（n = 5）。(h)：不同治療后腫瘤切片的蘇木精 - 伊紅（H&E）染色圖像。(i)：不同治療后 4T1 荷瘤小鼠在接下來 14 天內的體重變化（n = 5）。
