本文以 NirVivo-Pro NIR-II小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)作為靶向骨成像和改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）治療的設(shè)備。無創(chuàng)精準(zhǔn)的骨相關(guān)疾病診療手段需求迫切，但現(xiàn)有骨成像發(fā)光劑和 RA 治療藥物存在諸多問題，如成像分辨率低、藥物體內(nèi)清除困難及有全身并發(fā)癥等。原子精確的 Au NCs 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，基于 Au NCs 的 NIR-II PL 探針具有高時(shí)空分辨率和組織穿透深度，但將骨特異性 NIR-II PL 成像與增強(qiáng)的 RA 治療功能相結(jié)合面臨挑戰(zhàn)。文章介紹了一種基于近紅外 II 區(qū)（NIR-II）發(fā)射的 Au??納米團(tuán)簇（NCs）磷酸化的診療探針，用于靶向骨成像和改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）治療。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
· 制備 Au??MBA?? - P 探針
采用 “NaOH 介導(dǎo)的 NaBH?還原” 法合成 NIR-II 發(fā)射的 Au??MBA?? NCs，通過簡(jiǎn)單交聯(lián)策略將 3 - 氨基 - 丙烷 - 1 - 磷酸（APP）分子與表面配體 4 - 巰基苯甲酸（MBA）共軛，制備磷酸化的 Au??MBA?? - P 探針。
圖 1(A)：Au??MBA?? - P 的示意圖。注：磷酸基團(tuán)用綠色圓圈標(biāo)記，方案中僅顯示部分配體。(B)：Au??MBA??和 Au??MBA?? - P 的紫外 - 可見（UV - vis）吸收光譜。(C)：Au??MBA?? NCs 的電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）和同位素模式（ 黑色曲線：實(shí)驗(yàn)獲得；紅色曲線：理論模擬）。(D)：動(dòng)態(tài)光散射（DLS）圖譜，(E) 第二近紅外窗口（NIR-II）光致發(fā)光（PL）發(fā)射光譜（激發(fā)波長(zhǎng) λ = 808nm；此處，NCs 濃度固定為 20μM），以及 (F) Au??MBA??和 Au??MBA?? - P 的傅里葉變換紅外（FTIR）光譜。MBA：4 - 巰基苯甲酸；P：膦酸酯。
· 驗(yàn)證相關(guān)性能
對(duì) Au??MBA?? NCs 和 Au??MBA?? - P 進(jìn)行紫外 - 可見吸收光譜、電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）、透射電子顯微鏡（TEM）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、NIR-II 光致發(fā)光（PL）光譜、傅里葉變換紅外光譜、元素分析等表征；通過體外與羥基磷灰石（HA）的親和力實(shí)驗(yàn)和體內(nèi) NIR-II PL 成像研究探針的骨靶向性能；以 RAW 264.7 細(xì)胞和 RA 大鼠模型進(jìn)行體外細(xì)胞毒性、抗炎性能和體內(nèi)治療效果、作用機(jī)制研究，并評(píng)估其生物safety。
圖 2(A)：羥基磷灰石（HA）在與 Au??MBA??（中間物品）和 Au??MBA?? - P（右邊物品）反應(yīng)前（左列）在可見光（上圖）和近紅外（NIR）光（下圖）照射下的照片。(B)：HA 沉淀（1mg）與 Au??MBA?? - P 和 Au??MBA??（0.6mg/mL，0.2mL）反應(yīng)后光致發(fā)光（PL）強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。(C)：HA 沉淀與不同濃度的 Au??MBA?? - P 和 Au??MBA??反應(yīng) 2 小時(shí)后的 PL 強(qiáng)度變化。(D)：HA 上清液在與不同濃度的 Au??MBA?? - P 反應(yīng) 2 小時(shí)前后的 PL 強(qiáng)度變化。(E)：HA 上清液在與 Au??MBA??和 Au??MBA?? - P 反應(yīng) 2 小時(shí)后 PL 強(qiáng)度的下降比率。(F)：基于 (E) 中結(jié)果繪制的 HA 對(duì) Au??MBA?? - P 和 Au??MBA??的朗繆爾吸附等溫線。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巰基苯甲酸；P：膦酸酯。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
· Au??MBA?? - P 的特性
紫外 - 可見吸收光譜、ESI-MS、TEM 和 DLS 表明 Au??MBA?? NCs 成功合成，核心尺寸 1.54nm，HD 約 2.33nm，具有強(qiáng) NIR-II PL（量子產(chǎn)率約 4.5%，發(fā)射峰在 1080 和 1280nm）。
磷酸化后，Au??MBA?? - P 的光學(xué)吸收、核心尺寸、HD 和 NIR-II PL 發(fā)射基本不變，傅里葉變換紅外光譜證實(shí) APP 與 NCs 成功共軛，元素分析顯示每個(gè) Au??MBA?? NC 表面約結(jié)合八個(gè) APP 分子。
圖 3(A)：Au??MBA?? - P 尾靜脈注射（p.i.）后小鼠全身的時(shí)間進(jìn)程第二近紅外窗口（NIR-II）光致發(fā)光（PL）圖像（曝光時(shí)間 100ms，1000nm 長(zhǎng)通濾光片）。(B)：Au??MBA??和 Au??MBA?? - P 注射后軟組織作為背景（SBR）的時(shí)間進(jìn)程。Au??MBA?? - P 注射后 24 小時(shí)小鼠后爪（C）和側(cè)臥位小鼠（D）的 NIR-II PL 圖像。(E)：基于橫截面強(qiáng)度分布對(duì)肋骨（D 中紅色虛線）的半高全寬（FWHM）分析。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巰基苯甲酸；P：膦酸酯。
· 骨靶向性能
體外 HA 親和力實(shí)驗(yàn)表明 Au??MBA?? - P 與 HA 結(jié)合能力強(qiáng)于 Au??MBA??，HA 與 NCs 混合溶液的 PL 強(qiáng)度變化證實(shí)其快速結(jié)合，通過 PL 強(qiáng)度測(cè)定和 Langmuir 吸附等溫線計(jì)算得出 Au??MBA?? - P 對(duì) HA 的蕞大吸附容量更高，密度泛函理論（DFT）模擬進(jìn)一步證實(shí)其更強(qiáng)的結(jié)合能力。
體內(nèi)成像顯示 Au??MBA?? - P 注射后迅速在骨骼聚集，10 分鐘即可檢測(cè)到脊柱和膝蓋攝取，12 小時(shí)可清晰識(shí)別多種骨骼結(jié)構(gòu)，背景信號(hào)逐漸降低，骨與軟組織信號(hào)比（SBR）高，24 小時(shí)后仍能實(shí)現(xiàn)高分辨率成像，且在主要器官中腎臟和肝臟 PL 信號(hào)較弱，表明其具有良好的腎清除率和生物safety。
圖 4(A)：不同濃度的 Au??MBA?? - P 和 Au??MBA??處理脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的 RAW 264.7 細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子 - α（TNF - α）的濃度依賴性抑制。(B)：白細(xì)胞介素 - 6（IL - 6）。(C)：白細(xì)胞介素 - 1β（IL - 1β）。(D)：前列腺素 E2（PGE?）。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巰基苯甲酸；P：膦酸酯。
· 治療效果
RAW 264.7 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明 Au??MBA?? - P 在 0.625 - 1mM 濃度下處理 24 - 48 小時(shí)無明顯細(xì)胞毒性，不引起溶血，且能抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子分泌，包括腫瘤壞死因子 - α（TNF - α）、白細(xì)胞介素 - 6（IL - 6）、白細(xì)胞介素 - 1β（IL - 1β）和前列腺素 E2（PGE?）。
在 RA 大鼠模型中，Au??MBA?? - P 和 Au??MBA??治療效果與甲氨蝶呤（MTX）相似，可減輕關(guān)節(jié)腫脹、降低臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分、增加體重，且對(duì)血液和生化參數(shù)無明顯影響，主要器官無病理異常；組織病理學(xué)分析和微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro - CT）成像顯示 Au??MBA?? - P 能更好地恢復(fù)軟骨與骨的界面，減輕炎癥，消除骨侵蝕，改善關(guān)節(jié)畸形，優(yōu)于 MTX。
圖 5(A - C)：用生理鹽水、甲氨蝶呤（MTX）、Au??MBA??和 Au??MBA?? - P 治療 6 周期間，膠原蛋白免疫誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠和未免疫正常大鼠（健康）的踝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)（A）、臨床關(guān)節(jié)炎評(píng)分（B）和體重變化（C）的進(jìn)展。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 5）。(D)：在給藥初始、中間和結(jié)束時(shí)間點(diǎn)，用生理鹽水、MTX、Au??MBA??和 Au??MBA?? - P 治療的 CIA 大鼠和健康大鼠的代表性照片。CIA 大鼠用生理鹽水、MTX、Au??MBA??和 Au??MBA?? - P 治療結(jié)束時(shí)血清（E - H）和關(guān)節(jié)組織（I - L）中腫瘤壞死因子 - α（TNF - α）、白細(xì)胞介素 - 1β（IL - 1β）、白細(xì)胞介素 - 6（IL - 6）和前列腺素 E2（PGE?）的水平。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3），*p < 0.05。MBA：4 - 巰基苯甲酸；P：膦酸酯。
· 作用機(jī)制
免疫組織化學(xué)分析表明 Au??MBA?? - P 通過降低核轉(zhuǎn)錄因子 κB（NF - κB）信號(hào)通路中磷酸化 IκB、磷酸化 p65 和活化的 IκB 激酶（IKK）水平，抑制促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗炎作用，且 Au??MBA?? - P 在降低這些指標(biāo)方面效果優(yōu)于 Au??MBA??。
圖 6(A)：未免疫大鼠和 CIA 大鼠關(guān)節(jié)切片的代表性組織病理學(xué)圖像。(B)：CIA 大鼠炎癥、軟骨和骨侵蝕的組織學(xué)評(píng)分。(C)：CIA 大鼠跖骨和踝關(guān)節(jié)的代表性微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro - CT）圖像。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3），*p < 0.05。MTX：甲氨蝶呤。
研究結(jié)論
Au??MBA?? - P 探針具有出色的骨靶向性能，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)骨 NIR-II PL 成像，有效抑制 RA 大鼠的炎癥反應(yīng)，恢復(fù)骨組織，治療效果優(yōu)于 Au??MBA??和 MTX，且具有低細(xì)胞毒性、良好的腎清除率和生物相容性，有望用于骨疾病的臨床治療。
圖 7(A)：免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)磷酸化 IκB 激酶（IKK）、磷酸化 IκB 和磷酸化 p65 的代表性圖像，以及關(guān)節(jié)組織中磷酸化 IκBα?（B）、磷酸化 p65?細(xì)胞（C）和磷酸化 IKK（D）的百分比。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3），*p < 0.05。MTX：甲氨蝶呤。
