本文以 NirVivo-Pro NIR-II小動物活體熒光成像系統(tǒng)作為引導(dǎo)的光療和光激活腫瘤免疫治療的設(shè)備。文章介紹了一種基于超小金納米團(tuán)簇（Au??NCs）的診療探針 Au??MBA?? - NLG，用于近紅外二區(qū) （NIR-II）光致發(fā)光（PL）成像引導(dǎo)的光療和光激活腫瘤免疫治療。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
· 制備 Au??MBA?? - NLG 探針
通過 NaOH 介導(dǎo)的 NaBH?還原法合成 NIR-II 發(fā)射的 Au??MBA?? NCs，再將其與免疫檢查點(diǎn)抑制劑 NLG919 分子經(jīng) 1O?可裂解的連接體 2,2′-(丙烷 - 2,2 - 二基雙 (硫代二基)) 二乙酸（PSDA）進(jìn)行表面修飾，得到 Au??MBA?? - NLG 探針。
圖 1(a)：Au??MBA?? - NLG 的近紅外光激活機(jī)制的工作原理。(b)：Au??MBA?? 和 Au??MBA?? - NLG 的紫外 - 可見吸收光譜。(c)：Au??MBA?? 的電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）。(d)：Au??MBA?? 和Au??MBA?? - NLG 的動態(tài)光散射（DLS）圖譜和（e）近紅外 II 區(qū)光致發(fā)光發(fā)射光譜（激發(fā)波長 λ = 808nm）。(f)：Au??MBA??和Au??MBA?? - NLG 作為激光照射時(shí)間函數(shù)的光熱溫度曲線（808nm，1.5W/cm2；此處，納米團(tuán)簇的濃度固定為 60μM）。(g)：Au??MBA??和 Au??MBA?? - NLG 作為激光照射時(shí)間函數(shù)的單線態(tài)氧（1O?）相對產(chǎn)生量。
· 驗(yàn)證相關(guān)性能
對探針進(jìn)行紫外 - 可見吸收光譜、電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）、動態(tài)光散射（DLS）、NIR-II 光致發(fā)光（PL）光譜、光熱性能、光動力產(chǎn)氧性能、NLG919 光激活釋放性能等表征；以 4T1 細(xì)胞為模型進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞毒性、光熱治療（PTT）/ 光動力治療（PDT）效果、免疫代謝干預(yù)機(jī)制研究；在荷瘤小鼠模型中進(jìn)行體內(nèi) NIR-II PL 成像、PTT/PDT 及協(xié)同免疫治療研究，并評估其生物safety。
圖 2(a)：用 808nm 激光照射（上圖）6 分鐘（1.5W/cm2）或在黑暗條件下（下圖）處理的 Au??MBA?? - NLG 處理的 4T1 細(xì)胞的光致發(fā)光圖像。(b)：基于 MTT 試劑盒測試，在黑暗或激光照射條件下，不同濃度的Au??MBA?? - NLG 對 4T1 細(xì)胞的細(xì)胞毒性和光熱測定。誤差棒，平均值（n = 5），*P < 0.05。(c)：用 PBS 處理作為對照或用 Au??MBA??和 Au??MBA?? - NLG 處理 12 小時(shí)后的 4T1 細(xì)胞的共聚焦光致發(fā)光圖像，然后用 H?DCFDA 染色，有或沒有 6 分鐘激光照射。綠色光致發(fā)光信號來自被 1O?氧化的 DCF。(d)：以空白為對照或用 Au??MBA??和 Au??MBA?? - NLG 處理 24 小時(shí)后的 4T1 細(xì)胞培養(yǎng)基中的相對犬尿氨酸（Kyn）含量，有或沒有 6 分鐘激光照射。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3），*P < 0.05。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
· Au??MBA?? - NLG 的特性
紫外 - 可見吸收光譜顯示 Au??MBA?? NCs 有三個(gè)特征吸收峰，ESI-MS 證實(shí)其合成，DLS 測得水動力直徑（HD）約 2.7nm，TEM 顯示核心尺寸小于 2nm，且具有強(qiáng) NIR-II PL（絕dui PL 量子產(chǎn)率約 4.5%，發(fā)射峰在約 1080 和 1280nm）。
Au??MBA?? - NLG 探針紫外 - 可見吸收光譜有新峰，表明 NLG919 成功共軛，每個(gè) Au NC 上共軛 NLG919 數(shù)量約為 9 個(gè)，DLS 顯示 HD 略增至約 3.1nm，NIR-II PL 發(fā)射峰基本不變，光熱和光動力產(chǎn)氧性能與 Au??MBA?? NCs 相似，光熱轉(zhuǎn)換效率分別為 35.6% 和 30.8%。
圖 3(a)：在腫瘤內(nèi)注射 Au??MBA?? - NLG 后不同時(shí)間點(diǎn)的 4T1 荷瘤小鼠的近紅外 II 區(qū)光致發(fā)光圖像。(b)：腫瘤部位 Au??MBA?? - NLG 的時(shí)間相關(guān)相對光致發(fā)光強(qiáng)度。(c)：沿著感興趣區(qū)域（ROI）中的白線獲取的光致發(fā)光強(qiáng)度分布。
· 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
MTT 實(shí)驗(yàn)表明 Au??MBA?? - NLG 在黑暗中對 4T1 細(xì)胞毒性低，在 808nm 激光照射下有顯著 PTT/PDT 效果。
H?DCFDA 染色證實(shí)光動力產(chǎn)生 1O?，通過測定 Kyn 和 Trp 含量，表明 Au??MBA?? - NLG 可抑制 IDO 表達(dá)和 Kyn 產(chǎn)生，激活免疫治療。
圖 4(a)：與時(shí)間相關(guān)的腫瘤植入和 Au??MBA?? - NLG 指導(dǎo)的聯(lián)合腫瘤治療的示意圖。(b)：靜脈注射 Au??MBA?? - NLG、Au??MBA??或生理鹽水的 4T1 荷瘤小鼠在 808nm 激光照射 10 分鐘（1.0W/cm2）時(shí)的紅外熱圖像。(c)：腫瘤部位不同照射時(shí)間的溫度變化。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 5），*P < 0.05。(d)：在有或沒有 808nm 激光照射 10 分鐘的情況下，來自 Au??MBA?? - NLG、 Au??MBA??和生理鹽水處理的小鼠的原發(fā)性腫瘤的共聚焦光致發(fā)光圖像。藍(lán)色光致發(fā)光顯示用 4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）染色的細(xì)胞核，而綠色光致發(fā)光表示來自單線態(tài)氧傳感器綠色（SOSG）的信號。
· 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
荷瘤小鼠模型中，Au??MBA?? - NLG 靜脈注射后，NIR-II PL 成像可清晰顯示腫瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，腫瘤部位 PL 強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。
治療實(shí)驗(yàn)中，Au??MBA?? - NLG 經(jīng) NIR 照射后，原發(fā)性腫瘤完全消除，遠(yuǎn)處腫瘤生長受抑制，肺轉(zhuǎn)移減少；可增加腫瘤組織中細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞和產(chǎn)生 IFN - γ 的 T 細(xì)胞數(shù)量，減少 Treg 細(xì)胞數(shù)量。
圖 5(a)：Au??MBA?? - NLG 或 Au??MBA??指導(dǎo)的抑制腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移的示意圖。不同處理的小鼠中（b）原發(fā)性腫瘤和（c）遠(yuǎn)處腫瘤的時(shí)間相關(guān)演變。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 5），*P < 0.05。(d)：各種處理后從小鼠獲得的墨水染色的整個(gè)肺和蘇木精 - 伊紅（H&E）染色的肺切片的照片。遠(yuǎn)處腫瘤中（e）CD3? T 細(xì)胞、（f）CD8? T 細(xì)胞、（g）產(chǎn)生 IFN - γ 的 T 細(xì)胞和（h）調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg 細(xì)胞）的數(shù)量。誤差棒，平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 5），*P < 0.05。
· safety評估結(jié)果
Au??MBA?? - NLG 介導(dǎo)的免疫治療對小鼠體重、主要器官組織學(xué)、血液生化、肝功能無明顯影響，Au 主要通過腎臟排泄，在腎臟和腫瘤有較高分布，表明其生物相容性良好。
研究結(jié)論
Au??MBA?? - NLG 探針可實(shí)現(xiàn) NIR-II PL 成像引導(dǎo)的腫瘤 PTT/PDT 和光激活免疫治療，有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，具有低毒性和良好safety，有臨床轉(zhuǎn)化潛力。
