本文以 NirVivo-Pro NIR-II小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)作為深層組織成像及血管相關(guān)變化動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的設(shè)備。血管靶向光動(dòng)力治療(V-PDT)是治療血管相關(guān)疾病的一種有效手段，但是目前對(duì)深層血管在V-PDT過程中形貌及功能變化的實(shí)時(shí)、高分辨可視化監(jiān)測(cè)依然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。本文開發(fā)了一種基于吡咯并吡咯氮雜 - BODIPY 的近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光團(tuán) PTPE3 NP，用于血管靶向光動(dòng)力治療（V-PDT）中血管功能障礙的動(dòng)態(tài)熒光成像，為評(píng)估 V-PDT 期間的血管反應(yīng)提供了一種有效的方法。
PTPE3 NP 的合成與表征
· 合成與結(jié)構(gòu)
以四苯乙烯（TPE）衍生物為電子給體（D）、吡咯并吡咯氮雜 - BODIPY（PPAB）為電子受體（A）合成了 PTPE1 - 3，通過 DFT 計(jì)算、吸收光譜和熒光光譜等手段對(duì)其進(jìn)行表征，結(jié)果表明 PTPE3 具有較好的性能，其在 THF/H?O 混合溶液中表現(xiàn)出聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特性，在水相中的熒光量子產(chǎn)率（FLQY）為 0.94%，摩爾消光系數(shù)（MEC）為 2.64×10? M?1 cm?1，熒光亮度為 248.16 M?1 cm?1。通過單晶 X 射線衍射分析，證實(shí)了 PTPE3 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
圖 1：PTPE 熒光團(tuán)的合成與表征(a) PTPE1 至 3 的合成和分子結(jié)構(gòu)。(b) 通過 DFT 理論計(jì)算的 HOMO、LUMO 和能隙Egap能級(jí)。(c) PPAB 和 PTPE1 至 3 在二氯甲烷中的歸一化吸收光譜。(d) PTPE3 在不同水體積分?jǐn)?shù)fw的 THF/H?O 混合物中的 FL 光譜。(e) PTPE3 的 FL 強(qiáng)度與 THF/H?O 混合物的fw。(f) PTPE3 的單晶分析和分子堆積。
· 納米粒子制備與性能
PTPE3 與 Pluronic F127 組裝形成納米粒子（PTPE3 NP），其平均直徑為 123 nm，水合粒徑為 156 nm，Zeta 電位為 - 13.2 mV。PTPE3 NP 在 1000 nm 以上發(fā)射的熒光亮度為 180.05 M?1 cm?1，具有良好的光穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性和活性氧 / 氮物種（RONS）穩(wěn)定性，在 1% 脂質(zhì)體模擬生物組織中，1300 nm 長(zhǎng)通濾光片下成像深度可達(dá) 6.5 mm。
圖 2：PTPE3 納米顆粒的表征。(a) PTPE3 納米顆粒的 DLS 結(jié)果和 TEM 圖像。(b) PTPE3 納米顆粒在水中的歸一化吸收和 FL 光譜。(c) 在 808nm 激光激發(fā)下，PTPE3 納米顆粒和 ICG 在水中的亮度比較（使用 1000 和 1300nm 長(zhǎng)通濾光片）。(d) 在連續(xù) 808nm 輻射（1Wcm-2）下，PTPE3 納米顆粒和 ICG（相同濃度，20pM）的光穩(wěn)定性。(e) PTPE3 納米顆粒在 0h、2h 和 24h 的 pH 穩(wěn)定性。(f) PTPE3 納米顆粒在各種活性氧和氮物種（RONS）處理后的 FL 強(qiáng)度變化。(g) 在不同深度的 1% 脂質(zhì)溶液中，填充有 PTPE3 納米顆粒的毛細(xì)管的 NIR-II 圖像（使用 1000 和 1300nm 長(zhǎng)通濾光片）。
PTPE3 NP 的體內(nèi)成像應(yīng)用
· 多尺度血管成像
PTPE3 NP 對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的毒性較低，具有良好的生物相容性。通過尾靜脈注射 PTPE3 NP 對(duì)小鼠進(jìn)行全身和局部血管（后肢、腸系膜、腫瘤）成像，結(jié)果表明 1300 nm 長(zhǎng)通濾光片下成像效果更好，可清晰觀察到血管結(jié)構(gòu)，分辨率較高，且能顯示腫瘤血管的微觀結(jié)構(gòu)。
圖 3：使用 PTPE3 納米顆粒進(jìn)行體內(nèi)多尺度血管的 NIR-II FL 成像。(a) 靜脈注射 PTPE3 納米顆粒（150μL，2.5mgmL-1）后，使用不同長(zhǎng)通濾光片的全身血管 NIR-II 圖像。(b) 使用 1000 和 1300nm 長(zhǎng)通濾光片的股血管圖像的信噪比（SBR）。(c) 用不同深度的 1% 脂質(zhì)溶液覆蓋小鼠腹部后，使用 1000 和 1300nm 長(zhǎng)通濾光片的股血管 NIR-II 圖像。(d) 使用 1000nm 長(zhǎng)通濾光片的后肢血管 NIR-II 圖像。(e) 使用 1300nm 長(zhǎng)通濾光片的后肢血管 NIR-II 圖像。(f) 腸系膜微循環(huán)的 NIR-II 圖像及通過 1300nm 長(zhǎng)通濾光片的相應(yīng)放大圖像（白色虛線矩形）。(g) 沿圖 3f 中白色虛線的橫截面 NIR-II 熒光強(qiáng)度分布。(h) 腫瘤血管系統(tǒng)的 NIR-II 圖像及通過 1300nm 長(zhǎng)通濾光片的相應(yīng)放大圖像（白色虛線矩形）。(i) 沿圖 3h 中白色虛線的橫截面 NIR-II 熒光強(qiáng)度分布。
· 循環(huán)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)成像
尾靜脈注射 PTPE3 NP 后，在 30 s 內(nèi)對(duì)麻醉小鼠進(jìn)行全身成像，可觀察到 PTPE3 NP 在體內(nèi)循環(huán)過程，其在心臟的熒光強(qiáng)度在注射后約 5 s 達(dá)到蕞大值，通過傅里葉變換分析證實(shí)熒光強(qiáng)度波動(dòng)與心跳有關(guān)，心跳頻率為 324 次 / 分鐘。PTPE3 NP 的血液循環(huán)半衰期為 86.5 min，主要在肝臟和脾臟代謝。
圖 4：循環(huán)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)跟蹤和 PTPE3 納米顆粒的血液循環(huán)時(shí)間評(píng)估。(a) 注射 PTPE3 納米顆粒后不同時(shí)間點(diǎn)的腹側(cè) NIR-II FL 圖像（曝光時(shí)間 = 30ms）。(b) 注射后前 30 秒內(nèi)心臟區(qū)域的 FL 強(qiáng)度隨時(shí)間變化（插圖：21 至 24 秒數(shù)據(jù)的放大視圖，灰色線為 5.4Hz 的正弦振蕩作為參考）。(c) 圖 4b 插圖中數(shù)據(jù)的傅里葉變換。(d) 注射 PTPE3 納米顆粒和 ICG 后不同時(shí)間點(diǎn)采集的血液樣本的 FL 強(qiáng)度。(e) 注射 PTPE3 納米顆粒和 ICG 后不同時(shí)間點(diǎn)的 Balb/c 裸鼠體內(nèi) NIR-II FL 成像。
V-PDT 過程中的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)
· 腸系膜微循環(huán)反應(yīng)監(jiān)測(cè)
以腸系膜微循環(huán)為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停褂醚策苌铮℉pD）作為光敏劑進(jìn)行 V-PDT，通過 PTPE3 NP 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)血管反應(yīng)。結(jié)果顯示，隨著激光劑量增加，血管出現(xiàn)收縮、血栓形成、血流中斷等現(xiàn)象，可準(zhǔn)確測(cè)量血流速度（BFV）變化，NIR-II 熒光成像能夠清晰顯示血管形態(tài)破壞、血栓形成和血流動(dòng)力學(xué)異常過程，且比激光散斑襯比成像（LSCI）具有更高的分辨率和圖像對(duì)比度。
圖 5：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)血管靶向光動(dòng)力治療（V-PDT）期間腸系膜微循環(huán)反應(yīng)。(a) 在 V-PDT 治療期間，由 NIR-II FL 圖像描繪的腸系膜微循環(huán)的功能和形態(tài)變化（1300nm 長(zhǎng)通濾光片，808nm 激光）。(b) 在 V-PDT 治療期間不同時(shí)間點(diǎn)的腸系膜血流（血管 1）的實(shí)時(shí) NIR-II FL 圖像（紅色箭頭所示為在毛細(xì)血管中跟蹤的選定點(diǎn)，用于評(píng)估 V-PDT 治療期間的血流動(dòng)力學(xué)異常過程）。(c) 血管 1 在 V-PDT 下不同時(shí)間點(diǎn)的血流速度（BFV）變化。(d) 在未注射 HpD 的情況下，不同時(shí)間點(diǎn)獲得的相對(duì) BFV 變化（通過激光散斑對(duì)比成像（LSCI）獲得）。(e) 通過 LSCI 獲得的 V-PDT 期間腸系膜微循環(huán)的血流圖像。(f) 通過 LSCI 獲得的 V-PDT 期間不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì) BFV 變化。
· 腫瘤血管破壞監(jiān)測(cè)
建立 4T1 皮下移植瘤模型，注射 PTPE3 NP 和 HpD 后，使用 635 nm 激光激活 V-PDT，通過 NIR-II 熒光成像實(shí)時(shí)記錄腫瘤血管反應(yīng)。結(jié)果表明，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)明顯出血，血管蕞終塌陷，而未注射 HpD 的對(duì)照組幾乎無變化。LSCI 成像結(jié)果與 NIR-II 熒光成像一致，但 NIR-II 熒光成像在成像深度和分辨率上更具優(yōu)勢(shì)。此外，V-PDT 對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯抑制作用，且 PTPE3 NP 無明顯副作用。
圖 6：實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) V-PDT 下的腫瘤血管破壞。(a) V-PDT 治療期間腫瘤血管破壞過程的示意圖。(b) 注射 PTPE3 納米顆粒（150μL，2.5mgmL-1）和 HpD（8mgkg-1）的 Balb/c 小鼠在 635nm 激光（100mWcm-2）下整個(gè)腫瘤血管的 NIR-II FL 圖像。(c) 相應(yīng)的放大腫瘤血管圖像（白色矩形），腫瘤內(nèi)可見不規(guī)則亮點(diǎn)（綠色箭頭）表示明顯出血。(d) 沿圖 6c 中白色線條的腫瘤血管橫截面強(qiáng)度分布（不同照射時(shí)間）。(e) 僅注射 PTPE3 納米顆粒的 Balb/c 小鼠在 635nm 激光下整個(gè)腫瘤血管的 NIR-II FL 圖像。(f) 相應(yīng)的放大腫瘤血管圖像（白色矩形）。(g) 沿圖 6f 中白色線條的腫瘤血管橫截面強(qiáng)度分布（不同照射時(shí)間）。(h) 使用 LSCI 觀察 V-PDT 下腫瘤血管的圖像。(i) 不同治療后 4T1 荷瘤小鼠的相對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)（n=5）。
